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Super SYBR Green qPCR Master Mix

Super SYBR Green qPCR Master Mix是一款用于實(shí)時(shí)定量PCR的即用型試劑盒。其中Super SYBR Green是一種新型的專(zhuān)門(mén)為qPCR和高分辨率溶解曲線(xiàn)分析設計的DNA結合染料，它通過(guò)一種“按需求釋放”的機制，極大地降低了對PCR擴增抑制性。包含一種化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA多聚酶。這種Taq酶2分鐘內可以被*激活，尤其適用于快速PCR反應。此外，這種Taq DNA多聚酶在室溫下沒(méi)有活性，不會(huì )對DNA造成污染，性能遠遠優(yōu)于市面上抗體修飾的熱啟動(dòng)酶。Super SYBR Green的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的安全性。常規的DNA結合染料存在潛在的致突變性?；谶@方面考慮，我們研發(fā)設計了Super SYBR Green染料，它不能透過(guò)細胞膜，因而不能與活細胞的基因組DNA結合，確保了其安全性。然而，其他所有的商業(yè)性PCR熒光染料都可以在幾分鐘內進(jìn)入細胞，例如SYBR Green I，是一種環(huán)境毒性接近溴化乙錠（EB）的誘變劑。

此外，Super SYBR Green qPCR Master Mix還有一個(gè)非常突出的優(yōu)點(diǎn)，即它的PCR產(chǎn)物可以直接用于凝膠電泳檢測，不需要額外添加任何核酸染料。試劑盒中的Super SYBR Green可以作為DNA預染的核酸染料，電泳后可以直接用于觀(guān)察DNA條帶。光譜特性：Ex/Em: 500/528nm，常規的凝膠成像系統，不需要做任何調整。

試劑盒組成

使用方法

1.實(shí)驗參考因素

1）如果使用玻璃毛細管進(jìn)行反應（Roche LightCycler用戶(hù)部分實(shí)驗用到），那么需要在反應體系中額外加入BSA（終濃度 ～0.5 mg/mL）；如果使用透明的塑料毛細管，則不需要添加BSA。

2）溶解曲線(xiàn)分析儀器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 ,HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480,Rotor-Gene 6000, ABI 7500 和Roche LightCycler480等儀器都可以用于qPCR和溶解曲線(xiàn)的分析。具體參照儀器生產(chǎn)商的使用說(shuō)明進(jìn)行數據的采集和分析操作。

3）ΔR 和 ΔRN：當比較眾多qPCR Master Mix產(chǎn)生的熒光信號強度時(shí)，需要注意比較的方法。通常ΔR是高于基線(xiàn)水平的熒光增量。一般來(lái)說(shuō)，10 μL 的 1× Super SYBR Green反應體系與50 μL ABI公司的1×PowerSYBR 或Invitrogen公司的1×SYBR Green I相比，可以產(chǎn)生更高的ΔR。ΔRN定義為ΔR除以ROX值。因此高濃度的ROX可以產(chǎn)生更低的ΔRN。當ROX被ABI 7500, iCycler IQ, MJ opticon, MJChromo4, MX3000或MX4000儀器zui大激發(fā)時(shí)，ΔRN會(huì )更小。因此，應用于商業(yè)SYBR Green Master Mix的較低濃度的ROX往往會(huì )產(chǎn)生更高的ΔRN。

4）預期的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)：根據對比實(shí)驗我們發(fā)現， Super SYBR Green Master Mix的PCR擴增曲線(xiàn)與SYBR Green I的MasterMix相比，其靈敏度和穩定性更高。由于SYBR 染料對DNA擴增的抑制性影響，基于SYBR染料的Master Mix在PCR達到Ct閾值后通常會(huì )延遲擴增5-7個(gè)循環(huán)數。相比較而言，SuperSYBR Green Master Mix可以使PCR持續擴增至50個(gè)循環(huán)。

5）Ct值：在相同條件下，使用Super SYBR Green和SYBR Green I進(jìn)行的qPCR反應，其Ct值相對誤差在+1或-1之間。

6）擴增片段長(cháng)度：為了使SYBR Green qPCR Master Mix的擴增效率達到*，推薦的DNA擴增長(cháng)度為50-200 bp，如果需要擴增更長(cháng)的DNA片段，那么需要適當延長(cháng)PCR的反應時(shí)間。

7）凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物：當使用Super SYBR Green MasterMix進(jìn)行PCR擴增反應后，如需進(jìn)行DNA凝膠電泳分析，只要在PCR反應溶液中加入DNA loading buffer，按常規程序上樣，跑電泳，不需要在制膠時(shí)額外添加核酸染料。使用254 nm UV激發(fā)器、凝膠成像儀，或SYBR Green濾光器可以直接觀(guān)察凝膠。另外，凝膠也可以用488nm 的激光凝膠掃描儀進(jìn)行觀(guān)察。

2.PCR反應體系

每管反應組分如下表所示(供參考)

注：1）cDNA模板：SYBR Green qPCR Master Mix適用于mRNA的定量分析。*步通過(guò)逆轉錄將mRNA轉錄成cDNA，第二步利用Super SYBR Green kit進(jìn)行cDNA的定量擴增。為了確保擴增效率，cDNA樣品的體積不要超過(guò)總反應體積的10%。為了定量轉錄水平，我們推薦使用no-RT的對照樣品，以排除可能的基因組DNA的污染。

注：2）一步法RT-qPCR用于mRNA的定量分析。首先引物設計時(shí)要盡量避免形成引物二聚體。我們建議合理優(yōu)化逆轉錄酶的使用量和逆轉錄過(guò)程的持續時(shí)間。耐熱的逆轉錄酶可以兼容Agilent, Fermentas, Lucigen和Life Technologies等各種儀器。如果可以，設計的引物Tm值盡量在55℃左右，逆轉錄及后續擴增反應也應在55℃。為了定量轉錄水平，我們推薦使用no-RT的對照樣品，以排除有可能的基因組DNA的污染。

注：3）模板濃度：DNA模板依照不同需求，其反應量也有所不同。推薦的基因組DNA的模板量范圍是50 pg-50 ng，推薦的cDNA 的模板量范圍是50fg-50pg。

注：4）參照染料ROX：對于某些固定型號的儀器，必須添加ROX才能測定Ct值。ROX的使用濃度可以參照表1（見(jiàn)第4頁(yè)）。ROX會(huì )給熔解曲線(xiàn)分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX雜峰干擾，在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項，然后再進(jìn)行數據的收集與分析。

3.反應程序設置

您可以根據擴增模板的性質(zhì)和儀器的功能，選擇以下三個(gè)程序之一進(jìn)行實(shí)驗。

A．兩步快速擴增法

這個(gè)程序適用于大多數引物Tm為60℃的擴增，溶解曲線(xiàn)遵循您所用儀器提供的標準流程執行。

注：5）變性時(shí)間：如果擴增片段較短，變性時(shí)間可以低于5 s，甚至可以低至0 s。當變性時(shí)間設置為“0”時(shí)，它僅僅意味著(zhù)溫度增加到96℃，然后沒(méi)有停留迅速降溫。設置時(shí)間5 s可以確保DNA較長(cháng)片段和高GC片段的變性。高性能的儀器會(huì )進(jìn)一步增加擴增子變性的可靠性。

B . 三步擴增法

這個(gè)程序適用于擴增溫度比退火溫度高的實(shí)驗。例如，如果擴增片段有相對較長(cháng)的引物，容易產(chǎn)生非特異性的擴增，在更高的溫度下進(jìn)行延伸可以降低非特異性擴增。溶解曲線(xiàn)遵循您所用儀器提供的標準流程執行。

注：6）退火溫度：退火溫度應根據引物Tm值設定，通常是50 -60℃為佳。不過(guò)，引物Tm值（和擴增溫度）應該設計盡可能地接近60℃（但仍在50 - 60℃范圍內），減少退火和變性溫度之間的差距。這樣溫度增加所需時(shí)間更少，進(jìn)而擴增效率更高。

注：7）擴增溫度：擴增溫度設定在72℃對于大多數擴增子通常效率更高。然而對于富含AT的擴增片段（> 70%）或含有AT富集補丁的擴增子，60℃延長(cháng)通?？梢垣@得更好的結果。

C．通用程序

此程序適用于幾乎所有qPCR儀器，也適用于使用快速擴增法無(wú)法達到較好效果的擴增子。

表1、根據PCR儀種類(lèi)不同，推薦ROX使用濃度